CD40
該試劑盒以 HRP標(biāo)記的鏈霉親和素復(fù)合物（HRP Streptavidin Conjugate，
HRP-SA）為基礎(chǔ)，可用于檢測(cè)血液,細(xì)胞、組織
CD40抗原。該試劑盒
、特異性強(qiáng)、定性定位 、背景清晰。在所用的 CD40一抗與相
，用生物化二抗與一抗特異性 ，zui后加 HRP-SA，形成抗
應(yīng)靶抗原
原—特異一抗—生物素化二抗—HRP-SA復(fù)合物，顯微鏡下觀察成像。
試劑盒所含試劑：
試劑A 通透液：0.1% Triton-X 100 10 mL（選用）
試劑B 封閉
試劑C （*分裝）已稀釋的即用型一抗（2.5ml）
試劑D （*分裝）生物素化 IgG 1支
（濃度1.5 mg/mL，稀釋 1:300~1:500）50 μL+抗體稀釋液20ml
（封閉用） 20 mL
試劑E HRP-SA復(fù)合物1支（濃度1 μM，稀釋 1:50~1:200）100 μL
試劑F DAB顯色液 5ml
用戶自備試劑：
1． 10mM TBS（pH7.2~7.4）
三
1.21g
7.6g
加蒸餾 800mL，濃鹽酸調(diào)pH值至7.2~7.4，zui后定容至1000mL
TBS-T：TBS+Tween 20（0.05%體積 ）
2．抗原修復(fù)液（依檢測(cè)抗原不同而選擇不同的修復(fù)液）
10mM pH6.0 檸檬酸
檸檬酸0.38g
檸檬酸三鈉2.45g
加蒸餾 900mL，濃鹽酸調(diào)pH值至6.0，zui后定容至1000mL
或：0.5M EDTA修復(fù)液（pH8.0）
EDTA·2H2O 186.1g
加蒸餾 700mL，用10mM NaOH調(diào)pH值至8.0，zui后定容至1000Ml
3.
10 mL
4. Tween 20 5 mL
石蠟包埋組織切片
實(shí)驗(yàn)步驟（建議方案）：
石蠟包埋組織切片3~4μm 厚度
1.烤片： 將待做切片
，于60℃恒溫烤箱中至少烤1 hr；
3次（即二甲苯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ），每次
2.脫蠟： 切片放
10 min；
3. ： 切片經(jīng)下行酒精 ，無(wú)
乙醇2 min；75%乙醇2min，自來(lái)
5min，95%乙醇2次（每次2min），85%
，ddH2O洗2×2min；
4.抗原修復(fù)： 根據(jù)抗體說(shuō)明書推薦方法進(jìn)行抗原修復(fù)，常采用高壓、微波（溫
度達(dá)到98~100℃）或酶消化修復(fù)法，室溫自然 ，自來(lái)
2min，TBS洗滌（2×2min）（
5步封閉。
5.封閉： 滴加試劑B，37℃濕盒孵育30 min；
，ddH2O洗2×
1）* 注：有些抗原勿需修復(fù)，
直接進(jìn)
6.加一抗：滴加用試劑C（即用型一抗），37℃濕盒孵育2 hr 或4℃過(guò)夜；
7.洗滌： TBS-T洗滌（3×5 min）；
8.封閉： 滴加試劑B，37℃濕盒孵育10 min；
9.加二抗： 滴加用抗體稀釋液稀釋的生物素化二抗（試劑D），37℃濕盒中孵育
30 min；
10.洗滌： TBS-T洗滌（3×5 min）；
11.封閉： 滴加試劑Tween 20，37℃濕盒孵育封閉20 min；
12.加HRP-SA： 滴加用試劑C稀釋的試劑E（1：50~200，終濃度5~20 nM），37
℃濕盒中孵育30 min；
13.洗滌： TBS-T洗滌（3×5 min），TBS洗滌（2×5 min）；
14.顯色：應(yīng)用DAB溶液（試劑F）顯色；
15.復(fù)染：自來(lái)
，復(fù)染，脫 ，透明；
16.封片： 待組織標(biāo)本干后，用試劑
封片；
17.觀察成像： 顯微鏡下觀察成像。
注意事項(xiàng)：
1. 修復(fù)后
，自來(lái)
，驟
。
2.
，用過(guò)的檸檬酸
用。
3. 若試劑為微量濃 ，用前應(yīng)低速離心，將
著的溶液離到底部。
4. 封片前一定要換用TBS
，以便洗去組織上殘留的Tween 20，否則會(huì)
影響
。
5. 如須復(fù)染細(xì)胞核，則在封片前復(fù)染或直接采用含有染核試劑的封片劑進(jìn)行封
片。
附1：
抗原修復(fù)方法
常用抗原修復(fù)液：檸檬酸
9.0）等等。
（0.01M pH6.0）、EDTA 抗原修復(fù)液（pH8.0 或
，在組織上滴加胃蛋白酶或胰蛋白酶，37℃孵育
。
，將脫蠟
一、酶消化修復(fù)法
切片脫蠟
，TBS
20~30min后TBS
二、微波抗原修復(fù)法
微波盒中加
切片架上，放
，中檔或
10~15min，取出微波
盒
，自來(lái)
，取出切片。因不同微波爐微波處理時(shí)間存在差異，
須自行調(diào)整。
三、直接高壓抗原修復(fù)法
取修復(fù)液于不銹鋼高壓鍋中加熱至 ，將組織切片
，修復(fù)
液
然
，蓋上鍋蓋，待噴
1.5~2.5min即可脫離熱源，自
，取出切片。此方法適用于較難檢測(cè)或核抗原的修復(fù)。
四、隔
不銹鋼高壓鍋中加自來(lái)
騰，將切片放
，微波盒中加
于微波爐中加熱至
，待噴
，
4~8 min即可
，自然
，取出切片。此方法適用
于較難檢測(cè)或核抗原的修復(fù)。
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